血小板功能的檢測包括測定血小板粘附、聚集和活化的能力。然而，在血小板相關(guān)疾病的診斷中，檢測血小板功能的方法常常是有爭議的。這通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，靜脈阻滯、抗凝劑選擇、離心，甚至標本處理不當?shù)纫蛩兀伎蓪?dǎo)致醫(yī)源性血小板激活，影響臨床診斷的價值。這就要求建立一種靈敏、、快速、簡便，可用于臨床常規(guī)檢測血小板功能測定方法。
 　　由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達水平的高低來判斷，近年來，文獻報道利用流式細胞術(shù)，特別是全血法流式細胞術(shù)，檢測血小板膜糖蛋白的表達［2］。該技術(shù)能靈敏、特異地檢測血液中活化血小板，并評價其功能?，F(xiàn)就全血法流式細胞術(shù)檢測血小板功能的方法及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀和潛力進行綜述。
　　一、全血法流式細胞術(shù)
　　1.方法學：流式細胞儀能快速測定大量個體細胞的特性。樣品中欲分析的細胞預(yù)先進行熒光標記，然后由壓縮氮經(jīng)硅管送達標本室，再以5 000～10 000個細胞/秒的速率逐個射入光敏感區(qū)。在適當波長的激發(fā)光作用下，被特殊染色的細胞發(fā)射出一定量的熒光脈沖訊號。探測器收集每個細胞的熒光訊號和光散射，然后傳入計算機進行分析。
　　傳統(tǒng)的流式細胞術(shù)檢測血小板膜糖蛋白的表達，常用的樣本是經(jīng)洗滌的血小板或富含血小板的血漿。由于血小板極易活化激惹，樣本經(jīng)離心、洗滌等步驟，容易人為地導(dǎo)致體外血小板激活，影響臨床診斷價值。為此，Shatti等［2］引入了全血法流式細胞術(shù)。該技術(shù)能使用全血樣本測定循環(huán)中血小板的活化狀態(tài)以及血小板對激活劑的功能應(yīng)答。
　　全血流式細胞術(shù)樣本制備步驟為：
　　抽血抗凝→稀釋→生物素化的檢測用單克隆抗體（單抗）→激動劑或緩沖液→固定（1%多聚甲醛）→FITC標記的鑒別用單抗→PE-卵白素→稀釋。
　　稀釋樣本是為了防止血小板聚集，否則單個血小板上的抗原量就測不出來了，因為流式細胞儀測定的是單個粒子的熒光，而不管這單個粒子是一個血小板還是幾個血小板的聚集體。當用凝血酶作外源激動劑時，為防止血小板聚集并形成纖維蛋白凝塊，可在全血標本中加入四肽化合物Gly-Pro-Arg-Pro （GPRP）［3］。固定這一步若不干擾單抗的結(jié)合，生物素化的檢測用單抗也可以在固定后加入。血小板鑒別用單抗可在針對血小板特異性膜糖蛋白GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa的單抗中任選一種。標記這單抗的熒光試劑可在FITC、PE、PE-CY53種熒光染料中任選。
　　樣本隨后用流式細胞儀檢測。通過熒光極性和特異性光散射鑒別出血小板后，檢測5 000～10 000個血小板表面的特異性熒光訊號。檢測結(jié)果可用兩種方法表示。一種是平均顆粒熒光強度，另一種是特異性熒光抗體結(jié)合陽性血小板的百分率。陽性血小板百分率法與熒光信號的放大倍數(shù)無關(guān)，且可以檢測受損傷部位血小板亞群的變化。如果檢測的是血小板表面某抗原的總量，則熒光強度法更為適合。譬如，在活化狀態(tài)下，血小板表面GPIb-IX-V復(fù)合物含量比靜息時低，但降低的幅度小，通常還不足以報告陰性結(jié)果［4］，這時用熒光強度法就比陽性血小板百分率法更合適。
　　目前傳統(tǒng)的流式細胞術(shù)還不能定量分析結(jié)合位點的數(shù)目，但Shatti等［2］利用125I和生物素雙標記的單抗進行研究，以PE-卵白素作為熒光結(jié)合試劑，發(fā)現(xiàn)碘標測定的結(jié)合位點數(shù)與熒光強度間有線性關(guān)系。因此，對于一個特定的單抗，一旦弄清這一線性關(guān)系，并知道熒光單抗上熒光素與抗體的摩爾比，就能利用流式細胞儀定量分析該抗體結(jié)合位點的數(shù)目。目前有一些商品試劑盒能定量測定結(jié)合到單個細胞上的抗體數(shù)目，但乏見用于血小板的報道。
　　2.優(yōu)缺點：與常規(guī)血小板功能測定法比，全血法流式細胞術(shù)有許多優(yōu)點。
　　首先，標本處理的簡化能避免血小板體外醫(yī)源性激活，并防止血小板亞群丟失；循環(huán)中的紅細胞、白細胞對血小板的活化有影響，因此本法能在zui接近受檢者體內(nèi)環(huán)境的條件下測定血小板功能。同時，由于使用了血小板鑒別用單抗，檢測的僅是血小板，而不會受其它種類細胞或碎片的干擾，保證了檢測的特異性。其次，在血栓性疾病中，通常只有小部分的血小板被活化；凝血酶體外活化血小板，也常表現(xiàn)為亞群激活；活化血小板表達CD62等膜糖蛋白也有明顯的異質(zhì)性［5］。本法能靈敏地檢測出少到1%的活化血小板亞群［6］，尤其是能分析單個或亞群血小板膜上活化標志物的變化，使檢測結(jié)果更接近真實。若同時使用FITC、PE、PE-CY5 3種熒光染料，本法通過三色標志一次能同時檢測兩個抗原標志物的變化。
　　此外，做一次檢測僅需2 μl血液，這一點，尤其適合于新生兒和血小板減少性疾病患者。本法不使用同位素，沒有放射性污染?！　∪魇郊毎g(shù)也存在不足之處。譬如，流式細胞儀價格高昂，檢測費用高，儀器操作復(fù)雜。為了避免體外活化，血樣需在45分鐘內(nèi)處理，不能久置。另外，流式細胞儀僅檢測循環(huán)中的血小板功能，而β-TG、PF4和TXA2的檢測還能反映血管壁上血小板的活化和新近被清除的血小板。雖然存在著這些不足，但本法仍是血小板功能檢測的突破性進展。
　　二、全血中活化血小板的檢測
　　1.血小板特異性膜糖蛋白：本法檢測血小板功能，首先要對全血中的血小板進行特異性熒光標記，將血小板與血樣中其他血細胞區(qū)分開來。針對血小板表面特異性膜糖蛋白制備的單抗，使血小板特異性標記成為可能。血小板膜糖蛋白已被深入研究［7］，表1顯示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在這些膜糖蛋白中，僅在血小板膜表面表達主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的幾種［8］。根據(jù)這些特異性糖蛋白制備的熒光單抗，能在全血中特異性地識別血小板，僅給血小板做上熒光標記。
表1　血小板膜上主要的糖蛋白及其功能

膜糖蛋白	基因家族	配基	功能
GPⅠa/Ⅱa	整合素（B1）	膠原	粘附
GPⅠc/Ⅱa	整合素（B1）	Fn	粘附
GPⅠc/Ⅱa	整合素（B1）	Laminin	粘附
GPⅡb/Ⅲa	整合素（B3）	Fb,vWF,Vn,Fn	聚集
Vn受體	整合素（B3）	Vn,?vWF,?Fn	粘附
GPⅠb/Ⅸ	LRG	vWF，凝血酶	粘附
GPV	LRG	?	凝血酶底物
GPIV		Thrombospodin	粘附
GP53			血小板-粒細胞
GMP140	選擇素		相互作用

注：vWF血管性假血友病因子；Fb纖維蛋白原；Fn纖維粘連蛋白；Vn體外粘連蛋；LRG富含亮氨酸家族 　　2.活化血小板的標志物：活化血小板與靜息血小板相比，其質(zhì)膜糖蛋白常發(fā)生顯著的變化，這些變化的糖蛋白便成為活化血小板的檢測標志物?！　∪魇郊毎g(shù)也是一種免疫學方法，活化血小板表面能通過免疫方法檢測的標志物可分為三類［9］：*類是血小板顆粒膜上的糖蛋白。血小板被激活時，其顆粒膜與質(zhì)膜發(fā)生融合，顆粒膜蛋白，如CD62、CD63，在質(zhì)膜上表達，成為活化血小板的分子標志。第二類是血小板質(zhì)膜表面變化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa（CD41/61）的PAC1表位［10］，它僅在血小板活化時才因構(gòu)象變化而顯露出來。因此，使用這個表位的熒光單抗，我們能更地在更早階段檢測到血小板的活化。另外，GPIV （CD36）雖然在靜息血小板上也表達，但活化血小板上表達量更高［9］；GPIb-IX-V復(fù)合物（CD42）則相反，與靜息血小板相比，活化血小板上表達量顯著降低［7］。它們都是活化血小板的分子標志。第三類是出現(xiàn)在活化血小板上能與血小板表面受體相結(jié)合的一些抗原，包括纖維蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。這些抗原在血小板表面的出現(xiàn)和消失在臨床檢測上也是有意義的。　　除檢測免疫性的分子標志物外，流式細胞術(shù)還能檢測一些反映活化血小板功能的非免疫性指標。如用Ca2+濃度敏感的熒光染料檢測胞內(nèi)Ca2+流［10］，用能進入血小板致密顆粒的熒光染料阿的平來檢測活化血小板的釋放功能［11］等。　　3.單抗的選擇：與血小板有關(guān)的CD單抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61，CD62，CD63 ，CD107a-b等?；罨“宓臋z測需選擇針對活化血小板標志物的CD單抗。表2列舉了活化血小板檢測的一些代表性單抗。