中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志 1998年第1期第1卷 論著

作者：黃行許 鮑永耀 黃輝張薇 霍霞 樸英杰

單位：510515 *軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室

關(guān)鍵詞：顯微鏡檢查,熒光/方法;巨噬細(xì)胞/生理學(xué)；鈣/分析；酸堿平衡；小鼠

　　摘　要　目的　細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺與胞漿的pH在不同因素作用下可以改變。研究可以同時(shí)檢測(cè)游離Ca²⁺與pH變化的方法激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。方法　用胞內(nèi)游離Ca²⁺和pH熒光探針

　　fluo-3/AM和SNARF-1/AM標(biāo)記小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，在激光掃描共聚焦顯微鏡（ACAS570）下，同時(shí)用zui適發(fā)射波長(zhǎng)分別為530 nm和大于605 nm的檢測(cè)器1和檢測(cè)器2檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)fluo-3/AM和SNARF-1/AM的熒光強(qiáng)度變化。結(jié)果　檢測(cè)器1和檢測(cè)器2分別只檢測(cè)反映細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺和

　　pH變化的fluo-3/AM和SNARF-1/AM所發(fā)熒光的變化；SNARF-1/AM和fluo-3/AM所發(fā)熒光相互不影響。結(jié)論　激光掃描共聚焦顯微鏡可同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺和pH的變化。

　　中圖號(hào)　R329.3

　　Simultaneous Detection of Free Cytosolic Calcium and Intracellular pH by Laser Scanning ConfocalHuang Xingxu, BaoYongyao, Huang Hui, et al.Central laboratory, First Military Medical 510515

　　microscope

　　university,

　　Abstract　Objective　Free cytosolic calcium and intracellular pH can have some changes due to certain

　　factors.It is to explore a method for simultaneous detection on the changes,that is,observation with laser scanning

　　confocal microscope.Methods　Ca²⁺-and pH-sensitive fluorescence probes of fluo-3/AM and SNARF-1/AM

　　were used to mark the peritoneal macrophages simultaneously. Then, the variations of the fluorescence were

　　detected with detector 1 （optimum emission wavelength: 530nm） and detector 2（optimum emission wavelength:＞605nm） of the laser scanning confocal microscope （ACAS570）.Results　Detector1 and 2 each detected the

　　variations of the fluorescence of fluo-3/Am or SNARF-1/AM of the Ca²⁺ or pH. The fluorescence of fluo-3/AM

　　and SNARF-1/AM did not influence each other. And the forms of the alteration in free cytosolic calcium and

　　intracellular pH of the macrophages varied when they were stimulated by different stimulators.Conclusion　Laser

　　scanning confocal microscope could be used in simultaneous detection of free cytosolic calcium and intracellular

　　pH.

　　Key words　microscopy,fluorescence/methods;macrophages/physiol;calcium/anal;acid-base equilibrium;

　　mice

　　細(xì)胞受各種因素作用時(shí)，胞內(nèi)Ca²⁺和pH發(fā)生變化^〔1〕，不過由于缺乏能同時(shí)檢測(cè)胞內(nèi)Ca²⁺和

　　pH動(dòng)態(tài)變化的方法，二者之間的關(guān)系仍不很清楚。近年來，隨著激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)和熒光探針的開發(fā)利用^〔2〕，新一代的胞內(nèi)游離Ca²⁺和pH熒光探針fluo-3/AM和SNARF-1/AM被分別用于胞內(nèi)游離Ca²⁺和pH變化的檢測(cè)^〔3,4〕。根據(jù)fluo-3/AM和胞內(nèi)游離Ca²⁺結(jié)合后在波長(zhǎng)530 nm處熒光強(qiáng)度隨游離Ca²⁺濃度升高而增強(qiáng)，而SNARF-1/AM的熒光強(qiáng)度在波長(zhǎng)＞605 nm時(shí)隨胞內(nèi)pH升高而增強(qiáng)，它們的激發(fā)波長(zhǎng)均為480 nm^〔5,6〕以及fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度不受SNARF-1/AM影響^〔3〕等特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，擬利用fluo-3/AM和SNARF-1/AM混合物同時(shí)著染巨噬細(xì)胞，以觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺和pH的動(dòng)態(tài)變化。

材 料 和 方 法

　　一、主要材料

　　帶雙檢測(cè)器的激光掃描共聚焦顯微鏡（ACAS570），美國(guó)Meridian公司生產(chǎn)。fluo-3/AM、

　　sNARF-1/AM，美國(guó)Molecular probes Inc產(chǎn)品。RPMI－1640、Hepes購(gòu)于Sigma公司。小牛血清，浙江杭州四青生物材料廠制品。其它試劑均為分析純。

　　二、細(xì)胞培養(yǎng)

　　體重20 g左右雌性正常昆明小鼠，按照鄂征等人的方法^〔7〕取腹腔巨噬細(xì)胞，以5×10⁵個(gè)/cm²的濃度接種于改裝35 mm Petri細(xì)胞培養(yǎng)皿底部的蓋玻片上，用含10％小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)于37^oC含5％CO₂的孵育箱內(nèi)。

　　三、熒光探針標(biāo)記

　　吸除培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液，用Hepes緩沖鹽溶液洗三次，分別在不同培養(yǎng)皿中滴入10μmol/L

　　fluo-3/AM、10μmol/L sNARF-1/AM和含10μmol/L fluo-3/AM和10μmol/L sNARF-1/AM的混合液0.3 ml，37^oC孵育30～60分鐘，吸除染液，用Hepes緩沖鹽溶液洗3次，再加入0.5 ml Hepes緩沖鹽溶液。

　　四、ACAS570檢測(cè)胞內(nèi)Ca²⁺和pH

　　將培養(yǎng)皿置于ACAS570載物臺(tái)上，選用40×物鏡，7％濾光片，確定激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，進(jìn)入Ratio－Generic－Image scan程序，打開檢測(cè)器1（zui適發(fā)射波長(zhǎng)530 nm）和檢測(cè)器2（zui適發(fā)射波長(zhǎng)大于605 nm），建立文件，作預(yù)掃描后選定*掃描參數(shù)，對(duì)選定視野掃描并存儲(chǔ)所獲信息。主要掃描參數(shù)如下：Pinhole1 600μm, pMT1 70%, PMT2 70%, Scanning Strength 20%, Laser

　　power 10 mW。

　　五、單檢Ca²⁺或pH時(shí)按張薇等人的方法^〔4〕，分別打開檢測(cè)器1或2進(jìn)行。

　　六、分析

　　雙檢分析進(jìn)入Ratio－Generic－Image analysis程序，調(diào)入分析文件，得出同時(shí)反映細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺和pH動(dòng)態(tài)變化的熒光強(qiáng)度變化曲線。單檢分析進(jìn)入Kinetics－Image－Analysis程序，分別調(diào)入分析文件，得出各自反映細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺或pH動(dòng)態(tài)變化的熒光強(qiáng)度變化曲線。

結(jié) 果

　　一、細(xì)胞熒光圖像

　　圖1和圖2分別為檢測(cè)器1和檢測(cè)器2同時(shí)打開時(shí)檢測(cè)到的fluo-3/AM和SNARF-1/AM的細(xì)胞熒光圖像。圖1顯示僅檢測(cè)器1檢測(cè)到fluo-3/AM所發(fā)熒光，同樣，圖2顯示僅檢測(cè)器2檢測(cè)到SNARF-1/AM所發(fā)熒光。

　　二、單測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺和pH的變化

　　單檢結(jié)果顯示，小鼠巨噬細(xì)胞未受到刺激時(shí)，fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強(qiáng)度不變，巨噬細(xì)胞內(nèi)的Ca²⁺和pH穩(wěn)定；加入維拉帕米（終濃度1μmol/L）后200 sec，fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度下降了0.45，SNARF-1/AM的熒光強(qiáng)度下降了0.2；加入腎上腺素（終濃度1μmol/L）后200 sec，

　　fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度上升0.35，SNARF-1/AM熒光強(qiáng)度下降0.2。

　　三、雙測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺和pH的變化

　　雙檢結(jié)果顯示，顯示小鼠巨噬細(xì)胞未受到刺激時(shí)，fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強(qiáng)度同樣不變。加入維拉帕米（終濃度1μmol/L）后200 sec，fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度下降了0.42，SNARF-1/AM的熒光強(qiáng)度下降了0.22（圖3）；加入腎上腺素（終濃度1×10μmol/L）后200 s，fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度上升0.36，SNARF-1/AM熒光強(qiáng)度下降0.21（圖4）。

　　圖3 歸一化維拉帕米（1μmol/L）處理巨噬細(xì)胞內(nèi)fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強(qiáng)度變化曲線圖,檢測(cè)器1表示fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度變化,檢測(cè)器2表示SNARF-1/AM的熒光強(qiáng)度變化,標(biāo)記示加樣時(shí)間圖4 歸一化腎上腺素（1μmol/L）處理巨噬細(xì)胞內(nèi)fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強(qiáng)度變化曲線圖,檢測(cè)器1表示fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度變化,檢測(cè)器2表示SNARF-1/AM的熒光強(qiáng)度變化,標(biāo)記示加樣時(shí)間

　　圖1　細(xì)胞內(nèi)游離鈣特異性熒光屏　flou-3/AM熒光圖，檢測(cè)器1可檢測(cè)到fluo-3/AM的熒光，但

　　幾乎未檢測(cè)到任何SHARF-1/AM的熒光圖2　細(xì)胞胞漿_PH特異性熒光探針SNARF-1/AM的熒光圖，檢測(cè)器2可檢測(cè)到SNARF-1/AM的熒光，

　　但幾乎未檢測(cè)到任何flou-3/AM的熒光

討 論

　　檢測(cè)器1和檢測(cè)器2只檢測(cè)到fluo-3/AM和SNARF-1/AM的細(xì)胞熒光圖像，表明檢測(cè)器1和檢測(cè)器2均有較嚴(yán)格的zui適發(fā)射波長(zhǎng)，適合同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)不同，特別是波長(zhǎng)相差較大的熒光。而且，經(jīng)維拉帕米和腎上腺素作用后，單檢和雙檢結(jié)果顯示fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度變化和SNARF-1/AM的熒光強(qiáng)度變化均基本一致。這不僅證實(shí)了fluo-3/AM的熒光強(qiáng)度不受SNARF-1/AM影響^〔3〕，也反映出SNARF-1/AM的熒光強(qiáng)度不受fluo-3/AM影響。這些，肯定了在激光掃描共聚焦顯微鏡下可用熒光探針fluo-3/AM和SNARF-1/AM同時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺和胞漿pH的動(dòng)態(tài)變化，從而為探討細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺和胞漿pH之間的關(guān)系創(chuàng)造了條件。

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,新近開發(fā)的激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)不僅可作原位實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè),具有實(shí)驗(yàn)過程快速, 樣品處理簡(jiǎn)便, 得到數(shù)據(jù)全面等優(yōu)點(diǎn)^〔2〕。還能顯示單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化，將檢測(cè)提高到單細(xì)胞水平。而且由于共焦鏡法實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化的連續(xù)追蹤，因而可準(zhǔn)確反映細(xì)胞在加樣瞬間的變化。

　　細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺和胞漿pH均與細(xì)胞功能相關(guān)^〔8〕。心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺升高伴隨胞漿酸化^〔9〕。

　　對(duì)巨噬細(xì)胞游離Ca²⁺及胞漿pH關(guān)系的初步研究結(jié)果顯示，盡管經(jīng)腎上腺素處理,巨噬細(xì)胞游離Ca²⁺及胞漿pH的變化和心肌細(xì)胞相似。但經(jīng)維拉帕米作用后，巨噬細(xì)胞胞漿pH和游離Ca²⁺均降低。這表明巨噬細(xì)胞胞漿pH變化并不象心肌細(xì)胞一樣由細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺升高引起。巨噬細(xì)胞內(nèi)游離Ca²⁺和胞漿pH之間的確切關(guān)系仍需進(jìn)一步探討。

　　參 考 文 獻(xiàn)

　　1 Hayashi H, Miyata H, Noda N, et al. Intracellular Ca²⁺ concentration and pH_i during metabolic inhibition.

　　am J Physiol, 1992, 262C:635-643.

　　2 Davin MS. Confocal scanning optical microscopy and its applications for biological specimens. J Cell Science,

　　1989, 94（2）:175-206.

　　3 Rijkers GT, Justement LB, Griffioen AW, et al. Improved method for measuring intracellular Ca²⁺ with fluo-3.

　　cytometry, 1990, 11: 923-927.

　　4 張薇，樸英杰，鮑永耀，等.粘附式細(xì)胞儀測(cè)定巨噬細(xì)胞內(nèi)游離鈣的方法.*軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，

　　1994, 14（1）：43-45.

　　5 Seksek O, Henry Toulme N, Sureau f, et al. SNARF-1 as an intracellular pH indicator in laser

　　microspectrofluorometry: A critical assessment. Anal Biochem, 1991, 193: 49-54.

　　6 Richard PH, Molecular Probe. Handbook of fluorescent probes and research chemicals, 5th Edition, USA,

　　1994:223-224.

　　7 鄂征主編.組織培養(yǎng)技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社，1993:185-187.

　　8 Wray S. Smooth muscle intracellular pH: Measurement, regulation, and function. Am J Physiol,

　　1988, 254C:213-225.

　　9 Daugirdas JT, Arrieta J, Ye MH, et al. Intracellular acidification associated with changes in free cytosolic